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摘要 HBF工藝（hybridbiological&fixedfilmtechnology）是廢水處理的一種有效方法，且填料是該工藝的核心。然而，典型填料對污水處理性能的影響及其機制并不清楚。為此，采用軟性填料（RT）、彈性填料（TT）、組合填料（ZT）、酶浮填料（MT）、聚酯填料（JT）和滌綸填料（DT）6種填料構(gòu)建HBF反應(yīng)器處理生活污水。結(jié)果表明，測試期內(nèi)COD平均去除率差異不顯著（P＞0.05），而氨氮的平均去除率差異顯著（P＜0.05），且MT反應(yīng)器的COD及氨氮平均去除率均最高。為揭示其差異形成原因，比較了不同反應(yīng)器內(nèi)生物膜干重、微生物活性、微生物群落組成及硝化細菌功能基因（amoA、NSR）的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物膜干重差異顯著（P＜0.05）且微生物活性差異顯著(P＜0.05)，生物膜上的細菌群落結(jié)構(gòu)不同但優(yōu)勢菌群均為變形桿菌門、擬桿菌門及厚壁菌門等，MT中amoA、NSR拷貝數(shù)均顯著高于其他5種填料（P＜0.05）。因此，HBF工藝不同填料污水處理性能的差異主要是由生物膜的生物量及功能微生物組成兩方面導致。
關(guān)鍵詞 HBF工藝 填料 污水處理 微生物群落
中圖分類號：TU992；X52文獻標識碼：A文章編號：1009-0177(2018)08-
DOI:10.15890/j.cnki.jsjs.2018.08.
HBF工藝（hybridbiological&fixedfilmtechnology）是在A/O活性污泥法基礎(chǔ)上，結(jié)合生物膜法的優(yōu)勢而開發(fā)出的一種復合式生物膜-活性污泥法工藝[1]，填料是該工藝核心部分。研究表明，不同填料對生物膜法污水處理性能影響顯著[2-4]，在生物接觸氧化工藝處理生活污水中，軟性纖維填料較彈性立體填料和懸浮球型填料，對生活污水中有機物及氨氮的去除效果較好，且填料對生物膜法污水處理性能影響更顯著的是對氨氮的去除，而對去除COD的影響較小[4]。然而，在HBF工藝中，填料的不同對其污水處理性能有何影響尚不清楚。
填料的表面性質(zhì)直接影響其對微生物掛膜性能及附著生物類型[5]。同時，生物膜結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性和微生物分布的復雜性，為生物膜的內(nèi)部傳質(zhì)和外部傳質(zhì)提供了不同的微環(huán)境[6]。為此，污水處理性能的差異可以通過附著生物量、生物相組成及反應(yīng)器中的傳質(zhì)行為等過程來實現(xiàn)[7]。譚沖等[8]發(fā)現(xiàn)不同填料反應(yīng)器污水去除效率的差異原因可歸結(jié)為生物膜負載量及生物膜上的微生物菌群組成。Hoang等[9]分析了常溫和低溫下MBBR系統(tǒng)中生物膜的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)傳質(zhì)的差異可導致生物膜中微生物結(jié)構(gòu)的差異。然而，HBF工藝中不同填料反應(yīng)器的污水處理性能差異的主要原因并不清楚。
為此，本文開展以下內(nèi)容的研究：（1）研究不同填料對HBF反應(yīng)器污水處理效率的影響；（2）不同填料反應(yīng)器內(nèi)生物膜干重及脫氫酶活性，揭示其差異形成的初步機制；（3）基于細菌群落結(jié)構(gòu)組成和熒光定量PCR分析，揭示不同填料污水處理性能差異的微生物學機制。
1材料與方法
1.1試驗材料
本試驗所用的填料包括酶浮填料（MT）、聚酯填料（JT）、滌綸填料（DT）、軟性填料（RT）、彈性填料（TT）和組合填料（ZT）。采用人工裁剪方式，將前3種填料剪成條狀（2cm×15cm），固定在ZT配套的骨架上，且底端固定填料以保證其在反應(yīng)池中相對穩(wěn)定的狀態(tài)。6種填料性質(zhì)及掃描電子顯微鏡（SEM）圖分別如表1、圖1所示。
1.2試驗裝置及運行工況
采用有機玻璃反應(yīng)器（圖2）實施廢水處理。反應(yīng)器有效體積為6L，其污泥濃度（MLSS）為3000mg/L，DO為5mg/L，污泥回流比100%。反應(yīng)器采用連續(xù)進出水，HRT設(shè)置為4~12h（表2）。人工配置的污水pH值為7.0，COD濃度為250mg/L，TN濃度為50~90mg/L，TP濃度為3mg/L及部分微量元素。
1.3水質(zhì)指標與分析方法
測定的水質(zhì)指標有COD、氨氮（NH4+-N）及TN。采用高錳酸鹽酸性法（GB11914—89）測定CODMn；采用納氏試劑分光光度法（GB7481—87）測定NH4+-N；采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB—11894—89）測定TN。
1.4生物膜量及微生物活性測定方法
采用干重法定量評價生物膜負載量[5]。將含有生物膜的溶液用0.45μm濾膜（使用前稱重）過濾，把濾膜置于溫控105℃的恒溫鼓風干燥箱內(nèi)，干燥至恒重，過濾前后的質(zhì)量差即為生物膜干重。結(jié)果取各反應(yīng)器運行第20、30、45、60d及80d所測結(jié)果的平均值。采用TTC-還原法[10]對脫氫酶活性進行測定。結(jié)果取各反應(yīng)器運行第20、30、45、60d及80d所測結(jié)果的平均值。
1.5微生物分析
1.5.1DNA提取及PCR擴增
從每個反應(yīng)器取適量的生物膜樣本，用PowerSoilDNA提取盒（QbiogeneInc.,Carlsbad,CA,USA）按照DNA提取盒內(nèi)說明書提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。PCR采用TransGenAP221-02:TransStartFastpfuDNAPolymerase。擴增采用的細菌16SrRNA引物序列為:338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'[11]；AOB引物序列為:amoA-1F:5'GGGGTTTCTACTGGTGGT-3',amoA-2R:5'CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3'[12]；NOB引物序列為:NSR1113R:5'-CCTGCTTTCAGTTGCTACCG-3'，NSR1264R:5'-GTTTGCAGCGCTTTGTACCG-3'[13]。
采用50μL反應(yīng)體系：10~100ng模板，25μL的2×TaqPCRMasterMix，1μL的25μmol/L引物，后用超純水補至50μL。
PCR反應(yīng)步驟：95℃下預變性10min；95℃下變性15s，60℃退火60s，共40個循環(huán)。全部樣本按照正式試驗條件進行，每個樣本設(shè)置3個重復。
1.5.2Miseq文庫構(gòu)建和Miseq測序
利用NEBNextDNA文庫制備試劑盒（NewEnglandBiolabs公司，USA）在PCR產(chǎn)物兩端加上短接頭，構(gòu)建出DNA文庫。經(jīng)MiSeqreagentkitV2試劑盒（Illumina公司，USA）處理后，委托美吉生物采用MiSeq測序儀進行測序。
1.5.3功能基因的熒光定量
使用實時熒光定量PCR（real-timeqPCR）中SYBRGreen方法對AOB的amoA及NOB的NSR基因進行定量分析。試驗中設(shè)置陰性對照，每個樣品做3個平行，同時以梯度稀釋的質(zhì)粒DNA和樣品DNA進行定量PCR反應(yīng)。AOB及NOB定量所用引物參見上述普通PCR擴增。擴增體系均為20μL：SYBRGreenPremixEXTaq酶（Takara，大連）10μL，濃度為10pmol/LAOB及NOB正反向引物各0.8μL，DNA模板1μL，用超純水補足至20μL。采用IQ5Thermocyler擴增儀（RG65HD，Corbett，Australia）進行定量PCR。定量PCR擴增程序如下：95℃預變性3min；95℃變性30s，53℃退火60s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)；最后在72℃延伸10min。
2結(jié)果與討論
2.1填料對HBF反應(yīng)器的污水處理效率的影響
按試驗方法，開展了填料對HBF反應(yīng)器污水處理效率的影響試驗，結(jié)果如圖3所示。由圖3(A)可知，不同填料反應(yīng)器的CODMn去除效率均大致呈“升高-下降-平穩(wěn)”的趨勢，以MT反應(yīng)器為例，在第7~19d，CODMn去除率從75.65%提高到97.32%；隨著HRT的下降（從12h到8h，第21~35d），CODMn去除率先小幅下降后回升，該階段平均去除率達95.40%；隨著HRT的持續(xù)降低（從8h到4h，第36~50d），CODMn去除率從最高98.58%下降到最低77.76%，后逐漸回升至80%以上，該階段測試期間平均去除率為87.16%。當HRT維持在4h時，即使進水NH4+-N濃度提高（從50mg/L到70mg/L（51~65d）再到90m/L（65~80d）），對CODMn去除率的影響較小，兩個階段測試期間CODMn的平均去除率分別為90.07%、88.44%。
HRT減少導致CODMn去除率下降的主要原因可能是水力負荷加大，一方面造成反應(yīng)器的有機負荷增加，另一方面過大的水力負荷對填料表面的生物膜產(chǎn)生了沖擊[14]。反應(yīng)器成熟后，即使進水NH4+-N濃度加大，CODMn去除率比較穩(wěn)定，可能原因是好氧反應(yīng)器內(nèi)異養(yǎng)菌活性較大，受進水NH4+-N濃度影響不是很大[15]。
總體來看，測試期間各填料反應(yīng)器CODMn平均去除效率介于79.35%~91.72%，其排序為MT＞JT＞ZT＞DT＞RT＞TT；填料對CODMn的去除影響差異并不顯著（P＞0.05）。
由圖3(B)可知，不同填料反應(yīng)器的氨氮去除效率變化規(guī)律整體呈上升的趨勢，中間有波動，整體平穩(wěn)，后期去除率有所下降。以MT反應(yīng)器為例，從第7~22d的NH4+-N去除率呈上升趨勢，最高達96.27%。隨著HRT的持續(xù)降低（從8h到4h，第36~50d），NH4+-N去除率有所下降，該階段測試期間NH4+-N平均去除率為92.65%。當HRT維持在4h時，進水NH4+-N濃度從50mg/L提高到70mg/L，再到90mg/L，反應(yīng)器對NH4+-N去除率影響不大，兩個階段測試期NH4+-N平均去除率為90.25%、89.57%。
HRT減少導致NH4+-N去除率下降的主要原因可能是系統(tǒng)水力負荷加大，硝化菌沒有足夠的時間完成對NH4+-N的降解，使各反應(yīng)器NH4+-N去除率存在波動。Liu等[16]研究表明，當NH4+-N負荷一定時，HRT的減小將造成NH4+-N轉(zhuǎn)化效率下降。第四、第五階段，HRT維持4h而NH4+-N濃度升高，導致NH4+-N去除率也有所降低，但變化并不明顯，其主要原因可能是進水C/N比降低，有機碳源量要求較高的異養(yǎng)細菌部分被淘汰，降低了種群的多樣性。據(jù)報道[17]稱當進水C/N比減小時，自養(yǎng)菌會代替異養(yǎng)菌在生物膜外層生長繁殖。總體來看，測試期間各填料反應(yīng)器的NH4+-N平均去除效率約67.12%~88.12%，其排序為MT＞JT＞ZT＞DT＞RT＞TT；填料對NH4+-N的去除影響差異顯著（P＜0.05）。
綜上可知，在不同工況下應(yīng)用HBF工藝處理不同負荷的生活污水時，不同填料反應(yīng)器對CODMn去除效率差異較�。≒＞0.05），而NH4+-N去除效率差異顯著（P＜0.05）。
2.2生物膜量及微生物活性分析
生物膜的形成與生長是實現(xiàn)污水處理的前提，生物膜量及活性是評價生物膜質(zhì)量的重要依據(jù)[18-19]。在廢水生物處理中，生物膜脫氫酶活性可反映處理體系中活性微生物量及其對有機物的降解活性，因而成為評價生物膜活性的指標[20]。因此，為揭示不同填料反應(yīng)器的去除效率差異較大的原因，按試驗方法測定了生物膜量及單位質(zhì)量生物膜的脫氫酶活性，結(jié)果如圖4所示。
由圖4(A)可知，不同填料的生物膜負載量及脫氫酶活性均差異顯著（P＜0.05）。MT負載的生物膜量最大，其干質(zhì)量達8.11g，而RT負載的生物膜量最小，其干質(zhì)量為6.07g；該指標大小順序為：MT＞DT＞JT＞ZT＞TT＞RT。圖4中脫氫酶的活性結(jié)果表明：活性最高的是JT（208.55μgTF/(g生物膜•h)），活性最低的是RT（180.43μgTF/(g生物膜•h)）；填料的生物膜活性大小順序為：JT＞MT＞ZT＞TT＞DT＞RT。由于不同反應(yīng)器的NH4+-N的去除效率差異顯著而對CODMn的去除效率差異較小，為定量評價兩指標對污水處理性能的影響差異，分析NH4+-N去除率與生物膜量及單位質(zhì)量生物膜的脫氫酶活性的相關(guān)性，結(jié)果如圖4(B)、圖4(C)所示。
由圖4可知，NH4+-N去除率受生物膜量及單位質(zhì)量生物膜的脫氫酶活性影響顯著，其相關(guān)系數(shù)均大于0.50，微生物組成決定了微生物脫氫酶活性。為此，本研究進一步分析了生物膜中的微生物群落結(jié)構(gòu)。
2.3生物膜中微生物群落結(jié)構(gòu)分析
按試驗方法分析了生物膜的微生物群落。由樣本的層級聚類分析（圖5(A)）可知，六個樣品中的微生物群落可以分為三個不同的類群：第一類包括樣本S3、S5及S6；第二類為樣本S2；第三類包括樣本S1及S4。層級聚類分析結(jié)果與對生物膜樣本的PCoA主坐標分析（圖5(B)）結(jié)果一致。主坐標分析（Principalcoordinatesanalysis，PCoA），可用來研究微生物群落組成的相似性或差異性。由圖5(B)可知，樣本S3、S5及S6聚集在一起，S1與S4聚集在一起，且均與S2相距較遠。以上結(jié)果說明不同填料上微生物組成存在差異。
為進一步揭示其群落結(jié)構(gòu)差異，基于細菌菌門水平（圖6）、變形菌門（表3）及菌屬水平（圖7）分析生物膜上的微生物群落結(jié)構(gòu)組成。由圖6可知，從菌門水平來看，不同填料反應(yīng)器中微生物群落組成的差異不是特別大。6種填料生物膜樣本的主要菌群均為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）及放線菌門（Actinobacteria）。以MT反應(yīng)器為例，其生物膜樣本變形菌門占比達56.2%，其次是擬桿菌門（25.3%）、厚壁菌門（14.8%）。其他5種填料生物膜樣本上的變形菌門占比介于28%~54.3%，擬桿菌門占比介于23.5%~57.3%，厚壁菌門介于9.2%~16.1%。該結(jié)果與前人研究結(jié)果相近，如Ma等[21]在序批式反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)的細菌群落組成中變形菌門（占比最大）、擬桿菌門及放線菌門占優(yōu)勢；Snaidr等[22]在常規(guī)活性污泥中對菌群多樣性的研究中發(fā)現(xiàn)變形菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢類群。在6個樣品中還有綠彎菌門（Chloroflexi）、浮酶菌門（Planctomycetes）、綠菌門（Chlorobi）及單胞菌門（Gemmatimonadetes）等，但所占比例均不同。其中綠菌門在顆粒化過程中有重要作用，能夠增強污泥的沉降性能。
如表3、圖7所示，從變形菌門微生物的分布、細菌菌屬水平分析可看出填料的差異對微生物群落組成形成了顯著差異。由圖6可知，各填料生物膜樣本中變形菌門的占比較大。變形菌門又分為五類，分別為α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱和ε-變形菌綱。國內(nèi)外研究[23]發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)在生物脫氮、生物除磷及諸多污染物降解過程中起重要作用的微生物均歸屬于變形菌門，其中β-變形菌綱包括某些AOB（包括亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira等））在內(nèi)等很多好氧或兼性菌，且AOB是其主要成員[24-25]；γ-變形菌綱則包括腸桿菌科(Enterobacteraceae)和假單胞菌科（Pseudomonadaceae）等；δ-變形菌綱包括脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）、脫硫菌屬（Desulfobacter）及NOB類的硝化刺菌屬（Nitrospina）等菌屬。
由表3可知，各樣品中β-變形菌綱及γ-變形菌綱類較多，這與Lin等[26]在人工污水系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)最豐富的菌種為β-變形菌綱，其次是γ-變形菌綱結(jié)果相似。以MT生物膜樣本為例，β-變形菌綱、γ-變形菌綱及δ-變形菌綱占比分別達33%、16%及6%。
綜合以上對生物膜上微生物的群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可知，不同填料反應(yīng)器中的微生物組成還是存在較大差異的。其中MT反應(yīng)器生物膜樣本變形菌門占比最多。結(jié)合圖3(B)各反應(yīng)器對氨氮的去除率，MT生物膜相比于其他5種填料生物膜可能存在相對較多的硝化菌，且包括大部分脫氮菌的變形菌門也占比最多（56.2%）。這可能就導致MT反應(yīng)器的污水去除效果較好。為進一步確定各反應(yīng)器生物膜樣本中硝化菌數(shù)量差異，本試驗對生物膜樣本上的硝化菌進行了功能基因（amoA、NSR）熒光定量PCR分析。
2.4生物膜硝化功能基因（amoA、NSR）熒光定量分析
